Effects of 970 nm diode laser irradiation on morphology, proliferation, and differentiation of gingival mesenchymal stem cells / Efectos de la irradiación con láser de diodo de 970 m sobre la morfología, la proliferación y la diferenciación de las células madre mesenquimales gingivales

Objective: The objective of this study was to investigate the morphology, proliferation, and differentiation of gingival mesenchymal stem cells (GMSCs) irradiated with a 970 nm Diode Laser (LLLT). It is essential to validate the efficacy of treatment, optimize irradiation conditions and guarantee the safety and quality of stem cells for future use in dental applications. Materials and Methods: GMSCs were cultured in standard conditions and irradiated with a Diode laser (970 nm, 0.5W) with an energy density of 9J/cm2. Cell proliferation was assessed with the WST-1 proliferation kit. GMSCs were differentiated into chondrogenic and osteogenic lineages. Cell morphology was performed with Hematoxylin/eosin staining, and quantitative nuclear analysis was done. Cell viability was monitored with trypan blue testing. Results: GMSCs subjected to irradiation demonstrated a significant increase in proliferation at 72 hours compared to the non-irradiated controls (p=0.027). This indicates that the 970 nm diode laser has a stimulatory effect on the proliferation of GMSCs. LLLT-stimulated GMSCs exhibited the ability to differentiate into chondrogenic and osteogenic lineages. A substantial decrease in cell viability was observed 24 hours after irradiation (p=0.024). However, after 48 hours, the cell viability recovered without any significant differences. This indicates that there might be a temporary negative impact on cell viability immediately following irradiation, but the cells were able to recover and regain their viability over time. Conclusions: This study support that irradiation with a 970 nm diode laser could stimulate the proliferation of GMSCs, maintain their ability to differentiate into chondrogenic and osteogenic lineages, and has minimal impact on the mor- phological characteristics of the cells. These results support the potential use of NIR Lasers in combination with GMSCs as a promising strategy for dental treatments.

Objetivo: El objetivo de este estudio fue investigar la morfología, proliferación y diferenciación de las células madre mesenquimatosas (GMSC) irradiadas con un láser de diodo de 970 nm (LLLT). Es fundamental validar la eficacia del tratamiento, optimizar las condiciones de irradiación y garantizar la seguridad y calidad de las células madre para su uso futuro en aplicaciones dentales.Materiales y Métodos: Las GMSC se cultivaron en condiciones estándar y se irradiaron con un láser de diodo (970 nm, 0,5 W) con una densidad de energía de 9 J/cm2. La proliferación celular se evaluó con el kit de proliferación WST-1. Las GMSC se diferenciaron en linajes condrogénicos y osteogénicos. La morfología celular se realizó con tinción de hematoxilina/eosina y se realizó un análisis nuclear cuantitativo. La viabilidad celular se controló con prueba de azul de tripano. Resultados: Las GMSC sometidas a irradiación demostraron un aumento significativo en la proliferación a las 72 horas en comparación con los controles no irradiados (p=0,027). Esto indica que el láser de diodo de 970 nm tiene un efecto estimulante sobre la proliferación de GMSC. Las GMSC estimuladas con LLLT exhibieron la capacidad de diferenciarse en linajes condrogénicos y osteogénicos. Se observó una disminución sustancial de la viabilidad celular 24 horas después de la irradiación (p=0,024). Sin embargo, después de 48 horas, la viabilidad celular se recuperó sin diferencias significativas. Esto indica que podría haber un impacto negativo temporal en la viabilidad de las células inmediatamente después de la irradiación, pero las células pudieron recuperarse y recuperar su viabilidad con el tiempo. Conclusión: En conclusión, este estudio respalda que la irradiación con un láser de diodo de 970 nm podría estimular la proliferación de GMSC, mantener su capacidad para diferenciarse en linajes condrogénicos y osteogénicos y tiene un impacto mínimo en las características morfológicas de las células. Estos resultados respaldan el uso potencial de láseres NIR en combinación con GMSC como una estrategia prometedora para tratamientos dentales.

Células madre mesenquimatosas y sus diferentes usos / Mesenchymal stem cells and their different uses

Introducción: las células madre mesenquimatosas (CMM) se diferencian de diversos tipos celulares para la regeneración de tejidos, esta característica sumada con la versatilidad del antígeno leucocitario humano (HLA) representan una eficaz alternativa para el tratamiento de enfermedades con tejidos deteriorados. Se pueden obtener a partir de médula ósea, cordón umbilical (CU) y sangre fetal. Objetivo: analizar los tipos de diferenciación de las CMM, sus métodos de extracción y su relación con bancos de sangre de cordón umbilical (BSCU), a fin de demostrar la eficacia de las CMM, en patologías que impliquen alteración de algún tejido u órgano. Metodología: se revisaron varias publicaciones en español e inglés en Pubmed, Clinicalkey y Science Direct; desde 2013 hasta 2020. Se usaron los términos sangre fetal, células madre mesenquimatosas, trasplante de Células Madre de Sangre del Cordón Umbilical y bancos de sangre. Con dicha información se redactó un panorama amplio sobre las células mesenquimales y como estas participan en diversas áreas de la salud, con un énfasis importante en sus usos terapéuticos y lo referente a de donde provienen. Conclusión: a través de la pluripotencialidad de las CMM, se han podido emplear en múltiples patologías pues reestablece tejidos o líneas celulares exitosamente. Así mismo, los recursos para su obtención son claves en la tolerancia de los pacientes, por lo cual una gran opción para su obtención es el CU, que actualmente cuenta con bancos exclusivos para esto. (AU)

Introduction: mesenchymal stem cells (MSC) differentiate into multiple cell types for tissue regeneration, this characteristic added with the versatility of human leukocyte antigen (HLA) represent an effective alternative for the treatment of diseases with damaged tissues. They can be obtained from bone marrow, umbilical cord (UC), and fetal blood. Objetive: analyze the types of differentiation of MSC, their extraction methods and their relationship with umbilical cord blood banks (UCBB), in order to demonstrate the efficacy of MSC, in pathologies that involve alteration of a tissue or organ. Methodology: several publications in Spanish and English in Pubmed, Clinicalkey and Science Direct were reviewed; from 2013 to 2020. The terms fetal blood, mesenchymal stem cells, Umbilical Cord Blood Stem Cell transplantation and blood banks were used. With this information, a broad overview of mesenchymal cells and how they participate in various areas of health was drawn up, with an important emphasis on their therapeutic uses and where they come from. Conclusion: through the pluripotentiality of MSC, they have been used in multiple pathologies as it successfully re-establishes tissues or cell lines. Also, the resources for obtaining it are key in the tolerance of patients, which is why a great option for obtaining it is the UC, which currently has exclusive banks for this.

Establecimiento e implementación de un protocolo simplificado de expansión y cultivo de Células Madre de Pulpa Dental Humana (DPSCh) / Estabelecimento e implementação de um protocolo simplificado para expansão e cultura de células-tronco da polpa dentária humana (DPSCh) / Establishing and implementing a simplified protocol for the expansion and culture of human dental pulp stem cells (hDPSCs)

Resumen Objetivos: Establecer e implementar un protocolo simplificado de extracción, aislamiento primario y cultivo de células madre derivadas de la pulpa dental humana (DPSCh). Analizar cuantitativamente y cualitativamente las células aisladas. Metodología: 10 terceros molares sanos donados por pacientes que concurrieron a la Facultad de Odontología, UdelaR y otorgaron su consentimiento escrito fueron procesados antes de las 48 hs. Se realizó la fractura de la pieza para la obtención del tejido pulpar y se procesó por el método explante. Se analizó viabilidad celular y expresión de marcadores por citometría de flujo en pasajes 4 y 12 y se corroboró mediante inmunocitoquímica. Resultados: Las células obtenidas presentaron una vitalidad mayor al 90% en todos los pasajes, observándose una morfología característica y expresión de marcadores de células madre mesenquimales CD90, C105, CD73, CD29 y 166 mediante citometría de flujo en ambos pasajes. Conclusiones: Se logró establecer un protocolo de aislamiento y expansión celular, con alta tasa de éxito de una población de DPSCh.

Resumo Objetivos: Estabelecer e implementar um protocolo simplificado para a extração, isolamento primário e cultura de células-tronco da polpa dentária humana (DPSCh). Analise as células isoladas quantitativa e qualitativamente. Metodologia: 10 terceiros molares saudáveis ​​doados por pacientes que frequentaram a Faculdade de Odontologia UdelaR e deram consentimento por escrito foram processados ​​antes de 48 horas. A fratura da peça foi realizada para obtenção do tecido pulpar e processada pelo método do explante. A viabilidade celular e a expressão do marcador foram analisadas por citometría de fluxo nas passagens 4 e 12 e confirmadas por inmunocitoquímica. Resultados: As células obtidas apresentaram viabilidade superior a 90% em todas as passagens, observando uma morfologia característica e expressão dos marcadores de células-tronco mesenquimais CD90, C105, CD73, CD29 e 166 por citometría de fluxo em ambas as passagens. Conclusões: Foi possível estabelecer um protocolo de isolamento celular, com alta taxa de sucesso e segurança para isolar o DPSCh.

Abstract Objectives: To establish and implement a simplified protocol for the extraction, primary isolation, and culture of human dental pulp stem cells (hDPSCs). To analyze the isolated cells quantitatively and qualitatively. Methodology: Ten healthy third molars were donated by patients who attended the School of Dentistry, UdelaR, and gave their written consent. The teeth were processed within 48 hours. The teeth were sectioned to obtain the pulp tissue and processed with the explant method. Cell viability and marker expression were analyzed by flow cytometry at passages 4 and 12 and verified by immunocytochemistry. Results: The cells obtained had a vitality greater than 90% in all passages. We found the characteristic morphology and the expression of CD90, C105, CD73, CD29 and 166 mesenchymal stem cell markers by flow cytometry in both passages. Conclusion: It was possible to establish a cell isolation protocol that is highly successful and safe to isolate hDPSC.

Effectiveness of umbilical cord mesenchymal stem cells in patients with critical limb ischemia.

INTRODUCTION AND OBJECTIVE: Transplantation of umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs) has been shown to be effective in treating critical limb ischemia (CLI). However, the mechanism of MSCs-mediated improvements, especially on the immune-inflammatory aspects of this disease, is still unknown. In this study, we investigated the changes in T-lymphocyte subpopulations and inflammatory mediators (such as IL-6, IL-10 and TNF-α) in PBMCs from CLI patients after UC-MSCs treatment and correlation between inflammatory mediators and EPCs. PATIENTS AND METHODS: 8 patients received UC-MSCs transplantation. Before the treatment, at 24h and 1 month thereafter, peripheral blood samples were collected from 8 patients and 8 healthy volunteers. Patients were evaluated for changes in IL-6, IL-10, TNF-α and levels of circulating EPCs. RESULTS: TNF-α and IL-6 serum levels increased at 24h (p=0.017, p=0.099) after treatment and then decreased at 1 month (p=0.031, p=0.072) compared with those before treatment. The percentages of CD3+T, CD3+CD4+T-lymphocytes and NK cells decreased significantly after UC-MSCs treatment (p=0.002, p=0.012 and p=0.029, respectively). TNF-α (r=-0.602, p=0.038) was shown to be inversely correlated with the number of circulating EPCs. CONCLUSIONS: This study demonstrates that UC-MSCs have anti-inflammatory and immunomodulation properties in CLI and suggests that UC-MSCs promote healing of non-healing wounds.

Células madre mesenquimales para la regeneración de tejidos: ¿Por qué siguen siendo una promesa sin cumplir? / Mesenchymal stem cells for tissue regeneration: ¿Why are they still an unfulfilled promise?

Desde su descripción inicial, hace ya más de 40 años, las células madre mesenquimales (MSC) fueron reconocidas como una importante alternativa para el manejo de enfermedades caracterizadas por la pérdida aguda o crónica de tejido, gracias a su capacidad de proliferación y diferenciación, lo cual les permitiría sustituir las células perdidas y de esta forma recuperar la estructura y función. Cada vez es más abundante la evidencia que sugiere el potencial de estas células para el manejo de un amplio grupo de enfermedades, al menos en modelos experimentales preclínicos. No obstante, esta capacidad no ha podido refrendarse contundente y consistentemente en ensayos clínicos. Con la presente revisión, se pretende presentar una visión del estado actual del desarrollo conceptual en torno a las capacidades terapéuticas de las MSC y un análisis crítico de algunos de los factores, que han impedido que estas sean una opción terapéutica usable en la práctica clínica diaria

Since they were initially identified more than 40 years ago, mesenchymal stem cells (MSCs) were recognized as an important therapeutic alternative for diseases characterized by acute or chronic loss of tissue, thanks to their proliferation and differentiation ability, which would allow the replacement of lost cells and their structural and functional recuperation. Evidence suggesting the therapeutic potential of these cells for a vast group of diseases increases day by day, at least in preclinical experimental models. However, clinical trials have been unable to obtain consistent and categorical results to demonstrate this capacity. This review aims to provide, an overview on the current status of the conceptual development on the therapeutic properties of MSCs, and a critical analysis of some factors which have hindered the application of this therapeutic option in daily clinical practice.

La terapia celular en la cardiopatía isquémica / Cell therapy for ischemic heart disease

La cardiopatía isquémica es la principal causa de muerte e insuficiencia cardiaca a nivel mundial. Esto hace de vital importancia el desarrollo de nuevas modalidades terapéuticas, que disminuyan la mortalidad y complicaciones a largo plazo en estos pacientes. Una de las principales líneas de investigación a nivel mundial es la regeneración miocárdica a partir de células progenitoras, con el fin de mejorar la función sistólica y diastólica de los pacientes con cardiopatía isquémica, además de incrementar su sobrevida. Con bases teóricas y fisiológicas sobre la función de estas células, se han llevado a cabo con gran entusiasmo a nivel mundial, estudios en animales y humanos para tratar de definir la utilidad del empleo de las células madre, en el manejo de los pacientes con cardiopatía isquémica. En la actualidad, la terapia regenerativa en la cardiopatía isquémica es considerada una herramienta terapéutica novedosa, de beneficios teóricos considerables y pocos efectos adversos. En esta revisión presentamos los fundamentos científicos básicos que apoyan el empleo de esta terapia, la evidencia clínica actual sobre su beneficio. Señalamos los puntos controversiales y las perspectivas sobre su empleo y utilidad a corto y largo plazo.

Ischemic heart disease is the leading cause of death and heart failure worldwide. That is why it is important to develop new therapeutic modalities to decrease mortality and long-term complications in these patients. One of the main lines of research worldwide is myocardial regeneration, using progenitor cells in order to improve systolic and diastolic function in patients with ischemic heart disease, as well as to increase their survival. There have been carried out, with great enthusiasm worldwide, human and animal studies to define the usefulness of stem cells in the management of patients with ischemic heart disease. Today, regenerative therapy in ischemic heart disease is considered a novel therapeutic tool, with substantial theoretical benefits and few side effects. Here we present the scientific principles that support the use of this therapy, discuss the current clinical evidence available; and point out the controversial issues still not clarified on its use and usefulness in the short and long term.

OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE DEL TEJIDO ADIPOSO Y SU POTENCIAL DE DIFERENCIACIÓN OSTEOGÉNICO / ADIPOSE TISSUE DERIVED MESENCHYMAL STEM CELLS, ISOLATION AND DIFFERENTIATION INTO THE OSTEOGENIC LINEAGE

El tejido adiposo es una de las principales fuentes de células madre de fácil obtención y con alto potencial de diferenciación hacia linajes celulares especializados. Con el objetivo de estandarizar la obtención de estas células y dirigir su diferenciación hacia el linaje osteogénico, se utilizó tejido adiposo procedente de liposucción y de abdominoplastia. Se aplicaron métodos de disgregación mecánica y enzimática del tejido para obtener las células. La morfología celular obtenida fue similar a fibroblastos y a células madre reportadas por otros autores. Se encontró una mayor eficiencia en el procesamiento del lipoaspirado en comparación con el tejido resultante de abdominoplastia, y la disgregación enzimática del tejido permitió una mayor liberación de células y una temprana adhesión al plato de cultivo. La inducción de las células madre derivadas de lipoaspirado hacia el linaje osteogénico permitió la observación, mediante tinción con alizarina roja S, de depósitos de calcio en la matriz extracelular en las células bajo condiciones de diferenciación, pero no en aquellas sin suplementos osteogénicos. Se obtuvieron cultivos de células madre derivadas de lipoaspirado con capacidad de diferenciación hacia el linaje osteogénico, a través de inducción controlada, que podrían ser utilizadas en la ingeniería de tejido óseo.

Adipose tissue is one of the main sources of stem cells readily available and with a high potential to differentiate into specific mesenchymal and non-mesenchymal lineages. Therefore, to standardize the collection of these cells, adipose tissue from surgical liposuctions and abdominoplasty was used. Methods of enzymatic and mechanical digestion were used to release the cells. With regard to cell morphology, the cells displayed a fibroblast-like spindleshaped morphology as cited by other authors. There was a higher efficiency in processing tissue from liposuctions compared with tissue from abdominoplasty. Likewise, the enzymatic digestion allowed faster initial cell adhesion than the mechanical digestion. Finally, calcium deposits were observed by alizarin red staining in cultures under osteogenic conditions, but were absent in cultures lacking osteogenic supplements. In conclusion, isolated adiposedderived stem cells were capable of osteogenic differentiation and therefore with potential applications in bone tissue engineering.

ISOLATION OF HUMAN BONE MARROW MESENCHYMAL STEM CELLS AND EVALUATION OF THEIR OSTEOGENIC POTENTIAL

Human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSCs) comprise a cell population capable of self-renewal and multilineage differentiation commonly isolated from bone marrow aspirates of large bones. Their osteogenic potential has been extensively exploited for the biological evaluation of scaffolds or biomaterials with applications in bone tissue engineering. This work aimed to isolate hBMSCs from femoral heads of patients undergoing total hip arthroplasty and to evaluate their osteogenic potential. Briefly, the trabecular bone was extracted and mechanically disaggregated; the released cells were cultured and non-adherent cells were removed after 4 days. The osteogenic potential was evaluated at the fifth passage after 14 and 20 days of induction, comparing cultures with and without osteogenic supplements, via Alizarin red staining and the quantification of the gene expression levels of the osteogenic markers collagen type I, osteonectin and bone sialoprotein through real-time RT-PCR. The obtained hBMSCs presented a stable undifferentiated phenotype after prolonged cell culture, matrix mineralization capabilities and expression of osteoblast phenotype upon osteogenic induction. The three markers were up-regulated in cultures under osteogenic conditions and 2 fold differences in their expression levels were found to be significant for the onset of the differentiation process. The obtained hBMSCs may have applications on the in vitro evaluation of the osteoinductivity of different biomaterials, bioactive molecules or tissue engineering scaffolds.

Las células madre mesenquimatosas de médula ósea humana (abreviadas hBMSCs) constituyen una fuente de células auto-renovables con alto potencial de diferenciación, comúnmente aisladas a partir de los aspirados medulares en huesos largos. Su diferenciación hacia el linaje osteogénico, por ejemplo, ha sido ampliamente utilizada para la evaluación biológica de biomateriales o matrices con aplicaciones en la ingeniería de tejidos óseos. El objetivo de este trabajo consistió en aislar hBMSCs a partir de la cabeza femoral de pacientes sometidos a artroplastia total de cadera, así como evaluar su potencial osteogénico. Brevemente, se extrajo el hueso esponjoso y se disgregó mecánicamente; las células desprendidas se cultivaron y las células no adherentes se eliminaron luego de 4 días. El potencial osteogénico se evaluó en la quinta generación de cultivo, mediante ensayos de diferenciación a 14 y 20 días donde se compararon cultivos con y sin suplementos osteogénicos. La evaluación se realizó mediante tinción con Alizarina Roja y la cuantificación de los niveles de expresión génica de los marcadores osteogénicos colágeno tipo I, osteonectinca y sialoprotiena ósea mediante RT-PCR en tiempo real. Las hBMSCs obtenidas presentaron un fenotipo no-diferenciado estable, así como la capacidad de mineralizar la matriz extracelular y expresar un fenotipo similar al osteoblasto durante la inducción osteogénica. Los tres marcadores evaluados se sobre-expresaron en los cultivos en condiciones osteogénicas, y se encontró que cambios hasta de 2X en sus niveles de expresión son relevantes para el desarrollo del proceso de diferenciación. El modelo de hBMSCS presentado podría ser utilizado para la evaluación in vitro de la osteoinductividad de diferentes biomateriales, moléculas bioactivas o matrices para ingeniería de tejidos.